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鼠单克隆抗体高通量筛选
Mouse monoclonal antibody screening

    克隆抗体介绍   

抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时,抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞(浆细胞)和记忆B细胞,大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养,就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群,即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体,称为单克隆抗体。

目前单克隆抗体在生物制药领域发挥扮演了极其重要的角色,如目前开发的以PD-1为代表的单克隆抗体药物、以Bites形式为代表的双特异性抗体和三特异性抗体药物,另外CAR-T细胞药物设计的核心为识别抗原的ScFV(单链抗体)结构。而这类具备治疗性价值的抗体分子大多从成千上万个可识别抗原的候选抗体分子中筛选获得。利用传统杂交瘤技术完成该流程的筛选是一个工作量巨大、实验周期长和实验成本高的工作,同时也面临筛选失败的风险,即筛选不到合适抗体。因此,急需创新性的筛选技术平台实现:抗体筛选通量高、筛选速度快、抗体成药性好的目标,进而满足医药产业对抗体药物开发的需求。

    核心技术介绍 —— 高通量抗体筛选技术平台   

思格生物在传统杂交瘤筛选方法上进行了技术迭代升级,突破原有技术的诸多局限,全面提升了抗体筛选的通量和效率。具体是依靠自主研发的杂交瘤单细胞固定分选技术,将杂交瘤进行抗原荧光染色和流式细胞仪分选,可将分泌阳性抗体的杂交瘤细胞单克隆分选至96孔板或384孔板直接获得抗体单克隆细胞,这一操作过程避免了传统杂交瘤技术繁琐的亚克隆工作,大幅度节约时间和成本,同时将抗体筛选通量提高2~3个数量级。

另外我们开发了强效小鼠免疫佐剂,可在短时间内免疫小鼠并获得超高血清效价、使小鼠体内产生高峰度和多样性的抗体序列。同时在电融合上实现了单只鼠融合获得百万数量级杂交瘤的效率,理论上通过强效免疫和高效电融合的组合,可覆盖获得小鼠体内95%以上的识别目标抗原的抗体序列。融合后的百万级别数量的杂交瘤通过流式分选,可短时间内获得100~500株强阳性抗体,这些抗体有效用于后续抗体活性评估,从中筛选获得有目标生物活性的抗体分子。

 

    技术特色   

动物免疫效果好:自主开发的强效动物免疫佐剂,可有效保护抗原结构并显著提高血清效价抗体滴度;
◆ 筛选通量高:根据项目需要,可交付100~500株ELISA阳性单克隆杂交瘤上清, 用于后续筛选和评估;
◆ 筛选周期短:最快10周交付杂交瘤上清。
◆ 检测评估体系完善:可完成抗体Elisa检测、FACS检测、亲和力检测、抗体表位分组分析、抗体中和活性&抑制活性分析等多项分析及检测

 


 

    筛选案例   

小鼠免疫

该项目靶点免疫方式为FC 融合重组蛋白作为抗原,对小鼠进行四次免疫,免疫佐剂为思格生物自主开发的PAP-1强效免疫佐剂,最后一次免疫采血检测,结果显示,血清稀释至12.8万倍时,OD值仍在2.0以上,免疫效果满足要求,进行后续融合。

■ 杂交瘤融合

      取效价高的2只小鼠脾脏、混合研磨并制备单细胞,将其与SP20细胞混合,利用电融合仪融合,融合后细胞在HAT 培养基中培养,培养数天后,存活克隆数大于200万;

■ 杂交瘤分选

将上述存活下来的杂交瘤细胞进行FACS 抗原染色并做单细胞分选,培养一周后,经ELSIA鉴定,获得约400株单克隆杂交瘤,进一步经流式鉴定,大约1/3克隆中分泌的抗体具备与细胞表面抗原结合活性。





    对外合作   





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