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技术 | 常用切片技术

发布时间:2021-06-30     浏览次数 :0

摘要

众所周知,在医药研究尤其是热门的癌症研究中,需要用到许多工具和材料包括待研究的组织或细胞标本。标本可用于检查细胞的形状和结构(形态),疾病状态,细胞内和细胞间的通讯,于是,怎样从活检组织的中取得。由于大多数生物材料既易碎又易腐烂,因此必须注意确保正确制备和保存它们。

本文中,将着眼于FFPE与冷冻组织的关系进行探讨。今天有两种主要的组织制备方法。几十年来,组织已被福尔马林(又称甲醛)浸透,然后包埋在石蜡块中(称为福尔马林固定石蜡包埋或FFPE组织)。随着可靠的超低温冷冻机和大量液氮供应的出现,冷冻组织作为长期储存的第二种手段已变得可行。这两种方法各有优缺点。以下是这些优点和缺点的比较两种保存方法。

FFPE

福尔马林固定石蜡包埋组织

福尔马林固定石蜡包埋的组织是储存标本的最常见方法,数十年来,医院病理学家一直在使用FFPE组织。从患者身上获取的活检样本时,将这些材料中的一些处理保存,以备研究使用——有时在患者的治疗过程中会参考以前的病生理组织。

还有一些研究人员保存人类捐赠的组织或动物身上收集组织以备研究所需。

以FFEP这些档案库称为“生物库”,可以由大学和医院开发,也可以由为研究社区服务的公司出于商业目的创建。建立档案库可以为后续研究提供有力支持。

由于建库涵盖的时间线很长,因此它们可以提供历史资料,并且可以输出大量数据。由于FFPE切片可以室温储藏,因此创建一个可长期保持稳定的大样本成本很低。

福尔马林和蜡保留了组织中细胞内部和细胞之间的脆弱结构,这使得关注细胞和组织形态的科学家得以使用FFPE组织进行科研工作,如病理学家可以通过研究活检组织的FFEP切片作为癌症的诊断依据。

FFPE处理同时可以保存组织中的蛋白质也得以保存,而不仅仅是在显微镜下可见的结构。组织学家可以使用荧光标记的抗体(或通过其他方式标记的抗体)特异性结合某些蛋白质,以验证它们是否存在于组织内的某些细胞中,以及这些蛋白质在患病组织与健康组织中的位置和数量是否不同。该方法称为免疫组织化学法(IHC)。由于FFPE是一种应用历史较久且成熟的组织存储方法,所以病理学家习惯于检查组织活检并运用活检结果进行诊断。

FFPE组织的缺点

福尔马林易挥发,有毒,而且气味难闻。大多数石蜡包埋和固定程序也很费力且费时。另外,在保留蛋白质的同时,蛋白质变性所以不再具有生物活性。所以切片中变形的达标可能与某些抗体无法结合(比如天然的该蛋白的抗体)。这会限制切片在如IHC研究中的价值,因此切片无法用于生化分析。

另一个问题是FFPE组织中的核酸(DNA和RNA)不能维持生物活性状态。尽管可以从储存的石蜡切片组织中分离核酸,但由于信息缺失,这种核酸的用途十分局限。

因此,FFPE组织可能并不适合所有分子遗传学分析。而且大部分FFPE流程尚未标准化,不能保证实验样品的处理是一致的。非标准化的制备方法会严重影响从中获得的结果——特别是在分子遗传分析的实验中。可以进行一些分子分析,但是当使用FFPE方法保存组织时会损失很多。

冰冻切片组织

冰冻方法——处理样本的新手段

作为与FFPE一样,用于分子遗传学分析的样本储存处理方法——冷冻的组织对于分子遗传学分析非常有效。

特别是将活检材料以“快速冷冻”方法浸入液氮中,然后在储存于-80摄氏度以下的冰箱中。因此,如果您使用“ -80”冷冻机和液氮,则很容易准备新鲜的冷冻组织。

冷冻组织阵列样品(如标题图所示)对于IHC分析也非常有用,因为在液氮速冻时,蛋白质得以天然状态保存。这些“天然”非变性蛋白质也可以以仍然活跃的形式分离出来,用于生化分析。但是,组织在室温下会迅速降解,并且在-20摄氏度下无法长期稳定的储存。

冷冻组织的弊端

必须尽快将组织冻结,然后将其保持超低温状态(-80摄氏度或以下)才能保证在需要的时候提供相应的材料。由于外科医生手术期间可能缺乏液氮来实现被切除肿瘤组织的冻存,以及可能缺乏专用的超低温冷冻机使组织始终保持冷冻状态,所以这在医院中是较难做到的。而冷冻组织建立的档案库比之于FFEP(可以在常温下稳定储存),更容易因为冰箱断电或机械故障变质。或者因工作人员操作失误引起样本的损坏污染等。

FFPE VS 冷冻组织

总结

总而言之,FFPE组织非常适合创建大量的组织档案进行研究。一旦准备好,FFPE组织就非常稳定(常温储存数年不会变质)。它不需要专用设备即可保持数十年的稳定性。数十年来,病理学家一直在用FFPE组织进行诊断,并且对此非常熟悉。FFPE组织也可以用于某些IHC研究。 FFPE纸巾可能不适合分析天然蛋白,并且通常不如遗传分析的基因分析类型(例如PCR,qPCR或下一代DNA测序)逊色。另一方面,冷冻组织保留了DNA,RNA和天然蛋白质。但是,由于断电,机械故障或实验室中的粗心大意,冷冻的组织档案可能很快丢失。病理学家对冷冻组织也不太熟悉,病理学家通常在对FFPE组织进行显微镜分析后做出诊断更准确。

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