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噬菌体展示技术表达ScFv

发布时间:2021-06-30     浏览次数 :0

疑惑

噬菌体展示技术起源于1985年,是一种用于筛选和改造功能性多肽、蛋白质和抗体的一种生物技术,广泛应用于蛋白组学、基因组学等分子生物学领域。目前噬菌体展示技术快速发展,在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用、人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术领域得到了广泛地应用,并对这些领域产生了深远地影响。但是目前我们对这种技术知之甚少,具体的方法步骤更是一窍不通。

收获

噬菌体展示技术是将蛋白质或多肽的编码基因插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,在阅读框正确且不影响外壳蛋白正常功能的情况下,使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达,融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面,并且不影响噬菌体的生命活动。最终,展示到噬菌体表面的蛋白保持正确的空间结构和生物活性,可以与靶分子结合和识别。

单链抗体(Single chain Fv,ScFv)是由一段弹性连接肽(Linker)把抗体可变区重链与轻链相连而成,是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位(图一)。现就兔ScFv制备简单阐述一下噬菌体展示技术。

第一步

兔免疫,这一步和我们公司的免疫方式相似,初免用弗氏完全佐剂,加强免疫用弗氏完全佐剂,免疫周期为2周,一般4-5次免疫后即可,取兔脾脏用来建立ScFv噬菌体展示库。

图一:不同种抗体片段简图

第二步

ScFv展示库建立,先从脾脏B细胞中提取总mRNA,通过逆转录得到cDNA,再通过特定的引物以cDNA作为模板扩增出轻链可变区和重链可变区DNA,再通过重叠PCR将轻链可变区和重链可变区通过Linker连接,得到总ScFv (NcoI-VL-Linker-VH-NotI)基因,将ScFv 基因连接到pIT2噬菌体载体(含抗性基因),再转化到大肠杆菌(Ecoli TG1)中,这样一个ScFv库就初步建成了。再将含有ScFv库的Ecoli TG1与KM13辅助噬菌体共培养,使ScFv 展示在噬菌体表面,最终通过收集噬菌体颗粒扩大ScFv基因库。

第三步

目的ScFv噬菌体颗粒富集筛选:这一步骤被称为淘选过程(图二),简单的步骤就是先包被特定抗原,再加入展示ScFv噬菌体颗粒库孵育,洗去非特异性的噬菌体体,再通过一定条件洗脱下目的ScFv噬菌体颗粒,将第一轮得到的ScFv噬菌体颗粒转染Ecoli TG1中,在进行下一轮富集筛选,一般经过四轮筛选即可得到特应性很强的ScFv噬菌体颗粒。最终筛选到的ScFv噬菌体颗粒转化进Ecoli TG1中,涂平板(平板含抗生素),筛选单克隆ScFv噬菌体颗粒,通过PCR,将产物测序。

图二:噬菌体展示技术简图

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