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高级又实用!无法拒绝的蛋白表达干货

发布时间:2021-06-30     浏览次数 :0

论坛天天泡,实验天天做,蛋白还是表达不好?

不要着急!

小编这就送上几种有效的策略,

对获得高产量、功能性重组蛋白非常有效哦!

哺乳动物表达系统克服了原核表达系统翻译后修饰蛋白表达的问题。表达的蛋白具备折叠和修饰的功能,高度人源化,可以用于结构、功能分析。利用哺乳动物细胞表达蛋白通常有两种方式:瞬时表达稳定转染(构建稳定细胞系)。

利用细胞稳定转染将外源基因转染至细胞染色体上,能够长期稳定地生产目的蛋白。但是实验成本高、周期长、操作难度大。

瞬时蛋白表达是指外源基因存在于游离的载体上,并没有转染到细胞的染色体。构建好质粒后,经过细胞复苏、转染、细胞培养、蛋白纯化等步骤即可得到目的蛋白。操作简单,实验成本低,周期短,最适合应用于快速、小规模制备一定量的重组蛋白和重组抗体。

快来看看如何提高瞬时蛋白表达吧!

这波操作快拿走!

策略一 :优化编码序列

根据特定的下游应用设计最佳的编码序列并选择最合适的表达载体。在开始蛋白表达之前,使用密码子优化算法 (如OptimumGene™或GenSmart Codon Optimization) 以及表达载体选择指南 (如金斯瑞的GenSmart™ Design工具) 可节省时间、精力和费用。你知道吗?金斯瑞可提供从基因合成(免费的密码子优化)到蛋白表达、纯化等一体化服务

策略二:提高蛋白溶解度

较低的蛋白质溶解度是造成重组蛋白表达产量低的一个关键因素。我们建议首先调整一些常用的表达条件参数来提高蛋白质的溶解度。

温度

对于HEK293和其它哺乳动物细胞系,建议在37°C、5% CO2孵箱中培养细胞。有些研究表明,在转染后24小时将温度从37°C降至33°C培养,可提高HEK293细胞的蛋白表达。

尽管不同供应商提供的基础培养基十分类似,但它们之间的微小差异可能会影响特定表达细胞系的生长。一定要优化外部成分的浓度、pH值、类型甚至是批次或批号,如添加到培养基中的血清。

培养基

培养基添加剂

在某些情况下,我们建议向培养基中添加特定的试剂来提升蛋白表达。例如添加组蛋白脱乙酰基酶抑制剂,使染色质解聚并增加整合基因的转录活性。或者,向培养基中加入特定的生长因子有助于提高蛋白产量。

策略三:使用融合伴侣

蛋白标签是插入到重组蛋白上的短肽序列,可以用于提高蛋白表达。通常会在蛋白表达结束时采用酶切或化学试剂去除。表1列举了常用的蛋白标签类型及其优缺点。

表1:常用标签列表

针对特定表达系统选择合适的标签取决于多种因素。如果目标是获得极高的产量,则需要使用助溶标签,比如GST有很强的翻译起始信号,能促进高水平的表达。但是,如果需要较低的表达水平,建议使用更严格的表位标签,如His标签。

策略四:优化纯化方法

根据下游应用和纯度要求设计不同的纯化方法。如果蛋白表达量高,那么使用一步式亲和纯化方法就能获得足够量和纯度的蛋白,满足各种下游应用。如果需要进一步纯化,亲和纯化后通常可以进行分子排阻色谱(Size Exclusion Chromatography, SEC)。如需更进一步纯化,则可使用离子交换色谱 (Ion Exchange, IEX) 。

  • 重组蛋白表达

    具备高效的哺乳动物细胞表达系统和丰富的蛋白表达经验,可实现重组蛋白高质量表达与制备。针对表达难度大且生物活性敏感的蛋白,可实现精准设计和优化表达策略,表达不成功不收费。

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  • 高通量鼠单抗筛选

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