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抗体纯化篇:ProteinA如何捕获抗体?

发布时间:2021-06-30     浏览次数 :0

亲和层析是利用待分离组分和其特异性配体间具有特异性亲和力,从而达到分离的目的。

原理:亲和层析是基于生物分子与其它配基分子之间(如抗原与抗体,酶和底物,激素与受体,核酸中的互补链,多糖与蛋白复合体等)的亲和吸附原理建立起来的。

蛋白质与层析载体上的配体通过共价键、范德华力、疏水力、静电力等作用发生生物学专一性结合形成复合物,共价链接在载体表面的功能团配体上。蛋白质亲和层析技术通过目标蛋白质与配体间通过特异性亲和力吸附而达到分离纯化的目的,具有生物专一性的特点,纯化效率高。

ProteinA是金黄色葡萄球菌的一种膜蛋白,具有与抗体特异性结合的能力,ProteinA亲和层析柱已成为应用广泛的纯化抗体的亲和柱,可从腹水,血清和细胞培养上清或细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。

天然ProteinA由5个IgG结合域和其他未知功能的非Fc结合域组成,分子量42KD,天然ProteinA对IgG的亲和能力很强,可以吸附大量IgG(见图5)。但同时,天然ProteinA的其他非结合域和非目标蛋白结合,这样被洗脱下来的蛋白纯度不够,会影响到后续的试验。

运用基因工程技术,克隆出ProteinA的基因,并对其结构改造,除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组RroteinA的琼脂糖凝胶柱在蛋白纯化中,的确提高了产物的纯度。一般使用具备较少B结构域的ProteinA柱能获得高纯度的IgG,洁洗脱条件温和,从而防止蛋白质集聚,保护蛋白活性。

ProteinA的结构示意图

抗体纯化的一个显著特点是ProteinA亲和层析的广泛应用,超过2/3上市抗体品种的生产使用ProteinA进行抗体捕获。ProteinA对抗体重链稳定区Fc有很高的特异性和亲和力,对抗体纯化有很好的通用性。

ProteinA对IgG的高亲和能一步去除培养上清中大部分杂质,包括核酸、宿主细胞蛋白和可能存在的病毒,抗体纯度达到95%或更高,收率近100%。ProteinA层析操作简便,离心过滤后的细胞培养液可直接加载,不需经过任何处理。

抗体加载后,先用缓冲液淋洗,去除与介质或抗体弱结合的杂质,然后利用强酸性缓冲液(pH3.0-3.5)洗脱ProteinA上结合的抗体,再利用酸性更强的缓冲液(PH约2.0)去除强结合杂质,进行介质再生。ProteinA的清洗可以使用盐酸胍、尿素或低浓度碱液。

ProteinA亲和层析还是一个有效的抗体浓缩步骤,洗脱液中的抗体浓度可达10g/L以上,大大缩小后续精纯的液体处理量。

ProteinA亲和层析工艺开发和优化的重点是抗体载量、停留时间(流速)、淋洗和洗脱条件。Shukla等考察了14个IgG抗体的ProteinA纯化,发现不同抗体间存在很大的差异,抗体的动态载量相差3倍(10-40g/L),洗脱需要的氢离子浓度相差一个数量级(pH3.0-4.1)。

利用相同的工艺,洗脱峰中宿主细胞蛋白浓度可以从接近完全清除到残留21OOOppm,聚集体浓度可以从1%-20%,说明即使使用类似的平台技术,也需对特定的抗体进行特定的工艺开发和优化。

ProteinA在使用过程中会发生脱落,脱落的主要原因是细胞培养液上清中含有蛋白水解酶,在上样过程中会对ProteinA进行水解。部分脱落的ProteinA与抗体结合,残留在洗脱液中。由于ProteinA具有免疫原性,需在下游精纯步骤中加以清除。

ProteinA虽然在抗体纯化中被普遍接受,但改进和寻找ProteinA替代物仍是抗体纯化研究的一个重点。

ProteinA在拥有高特异性、高亲和力和高通用性等优点的同时,也具有若干显著缺点,包括费用高、载量低、线性流速有限、需低pH洗脱、ProteinA脱落等。

ProteinA亲和介质比普通纯化介质贵大约10倍,在抗体生产成本中所占的比重高于其他任何一个原材料。抗体在ProteinA上的载量较低,动态载量通常在20-30g/L,造成介质用量高,进一步提高了使用成本。为控制生产成本,ProteinA通常会重复使用。

实验证明,利用较温和的清洗步骤,ProteinA介质可以重复使用高达300次。为了降低介质成本,大规模抗体纯化通常采用较小的ProteinA层析柱,将单批收获液分成多批进行ProteinA纯化,减小了纯化通量。ProteinA上样是亲和纯化的速度限制步骤。Ghose等建议,可利用双重上样流速缩短上样时间。

在上样初期,当抗体容易到达的结合位点为空时,采用高流速,等到抗体容易到达的位点被占领,抗体必须通过扩散达到孔内结合位点时,再采用低流速,给抗体更多的扩散时间,达到较高载量。

天然结构ProteinA在强碱清洗时会降解,所有只能使用低浓度碱液(约0.lmol/LNaOH),尿素或盐酸胍进行清洗,但尿素和盐酸胍废液处理困难,不适于大规模生产,而低浓度碱液在内毒素清除方面的能力有限。

MabSelectSuRe(GE)是一个改构的ProteinA,替换了ProteinA中易在碱性条件下降解(脱酰胺化)的天冬酰胺,从而使得重组ProteinA可以耐受强碱的清洗。

在改进ProteinA的同时,寻找和设计可以替代ProteinA的配体也是一个重要的研究方面。具备替代ProteinA潜力的配体包括多肽、适配子、化学合成配体等,但目前这些配体在结合力、特异性和通用性等方面还不能全方位达到ProteinA水平,离商业化应用尚有距离。在今后的5-10年里,ProteinA还将是占主导位置的抗体捕获介质。

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