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抗体如何进行精纯

发布时间:2021-06-30     浏览次数 :0

离子交换层析应用最为广泛,目标物质和带相反电荷的介质以静电力的作用结合,然后在用高离子或改变pH的方式进行洗脱。

特别要注意,蛋白的pI表征的是蛋白表面的净电荷,然而离子交换层析时是蛋白的局部电荷和介质作用,另外离子交换介质吸附的一类物质,如阳离子交换介质吸附带正电荷的物质,所以在纯化过程中,需要配合层析过程进来合理的结合及洗脱过程,才能达到预期的结果(原理见图6)。

图6 离子交换层析原理示意图

阳离子交换是另一个较常用的抗体捕获方法。至少有4个(Humira、Synagis、Soliris、Zenapax)在欧美上市的治疗性抗体药物采用了这种捕获方法,另外多个处于临床阶段的抗体品种也采用了阳离子交换捕获方法。

阳离子交换与ProteinA相比的最大优势是成本。离子交换介质价格仅为ProteinA的1/10,可重复使用百次以上,并耐受强碱清洗。另外,阳离子交换介质的抗体载量可达100g/L,是ProteinA的2-5倍,可降低介质使用量。

Arunakumari等开发了一个基于阳离子交换抗体捕获、阴离子交换精纯的两步抗体分离方法。在大大降低纯化成本,缩短纯化时间的同时,阳离子交换层析捕获收率达到82%,捕获后抗体纯度超过97%,作者显示此工艺可成功放大1000倍。

阳离子交换与ProteinA相比有两个劣势,一个是特异性差,另一个是通用性差,需针对不同抗体和抗体表达工艺进行优化,如不同抗体的等电点不同。即使是同一抗体,不同的翻译后修饰也造成不同的等电点,这些都影响到阳离子交换缓冲液pH的选择。

捕获后的抗体需进一步去除宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、抗体聚集体、抗体片段和脱落ProteinA,以达到对患者安全的纯度。精纯一般采用两步层析以保持足够的纯化冗余,但采用一步精纯的工艺也越来越多。

精纯步骤常用的方法包括阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水作用层析、羟基磷灰石层析和分子筛,其中阴离子交换和疏水作用采用流穿模式,阳离子交换和羟基憐灰石采用结合-洗脱模式。各个层析步骤的主要杂质去除能力见表1。

两步精纯工艺一般会选择一个流穿模式,一个结合-洗脱模式,而单一步骤精纯一般会选择流穿模式(因为捕获步骤为结合-洗脱模式)。精纯介质通常采用高效介质(直径10-30um)以提髙分离的分辨率,同时提髙抗体的回收率。但采用小粒径介质同时也限制了流速,延长了纯化时间。

表1 层析步骤对杂质的清除作用

离子交换是最常见的精纯步骤。经典的抗体纯化步骤采用流穿的阴离子交换和结合-洗脱的阳离子交换两步精纯。阴离子交换对宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白有很好的清除作用,而阳离子交换是去除多聚体和抗体片段的有效步骤。离子交换依靠抗体和杂质表面所带电荷差异将其分离。

抗体的电荷来自多个组成部分。赖氨酸、精氨酸、组氨酸可带负电荷,天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸可带正电荷,N-端的氨基可带正电荷,C-端的竣基可带负电荷,糖基化上唾液酸可带负电荷。

抗体上的净电荷取决于抗体的等电点和缓冲液的pH,当缓冲液pH低于等电点时,抗体带正电荷;当pH高于等电点时,抗体带负电荷。所以,通过调整缓冲液的pH,可以改变其在离子交换介质上的结合和流穿。需要指出的是,虽然一半以上氨基酸本身不带电荷,但它们会通过结构影响抗体的表面电荷,也会影响邻近酸性或碱性氨基酸的电荷。

阴离子和阳离子交换的区分在于介质上的活性基团,阴离子交换介质上的活性基团为阳性(带正电荷),可吸附流动相中的阴性离子,阳离子交换介质上的活性基团为阴性(带负电荷),可吸附流动相中的阳性离子。活性基团还可进一步分为强活性基团和弱活性基团,区分的标准是活性基团上所带电荷是恒定的还是随pH改变的。抗体纯化使用的一般为强活性介质。

离子交换层析首先要平衡介质

在介质上加载相反电荷离子,主要是钠离子或氯离子。平衡液选择的标准是抗体(结合-洗脱模式)或杂质(流穿模式)易于取代平衡时加载的反荷离子吸附在介质上,但吸附又不能太强或不可逆,从而易于洗脱。

第二步是样品的加载

样品加载时的缓冲液为低盐溶液,以促进抗体(结合-洗脱模式)或杂质(流穿模式)与反荷离子交换,在介质上的吸附。

第三步是淋洗

对于流穿模式,淋洗可采用平衡液,对于结合-流穿模式,淋洗可采用平衡液或可洗脱弱结合杂质的缓冲液,提高洗脱抗体纯化。

结合-洗脱模式的第三步是洗脱,洗脱依靠的是增加流动相中的盐浓度,增强反荷离子与抗体在介质上的竞争,从而洗脱介质上吸附的抗体和其他物质,洗脱下物质的顺序是从弱结合组分到强结合组分。

通过优化洗脱条件,可增加抗体与杂质在洗脱峰中分离的分辨率,从而有效去除杂蛋白、聚集体、抗体片段等杂质。离子交换的最后一步是再生,利用高盐缓冲液清除结合在介质上的所有物质,并在介质上重新加载反荷离子,准备下一个循环。

离子交换缓冲液中的缓冲体系应该在设定pH范围提供足够的缓冲能力,没有毒性,并且与抗体和介质没有相互作用。通常缓冲组分与介质应带相同电荷,所以不会在介质上吸附。线性洗脱可提高洗脱的分辨率,但在大规模生产中,为保证操作的稳定性,一般采取阶梯洗脱。

越来越多的公司开始使用一步精纯来提高收率和纯化速度,降低成本。Kelley等开发了一种一步精纯的弱分离阴离子交换层析(WPC)方法。

弱分离阴离子交换层析操作条件介于流穿与结合-洗脱之间,采用比流穿操作更低的离子浓度,以提高流动相中的杂质与介质的结合能力,提高了本步骤的杂质去除能力。低离子浓度同时也增加了抗体在介质上的吸附,造成部分抗体吸附在介质上(大部分抗体流穿)。

这部分弱吸附上抗体可以通过一个短暂的淋洗洗脱,保证抗体收率。Kelley等显示,ProteinA捕获和弱分离阴离子交换组成的两步抗体纯化工艺可满足抗体在宿主细胞蛋白、ProteinA、内毒素和宿主核酸的清除要求。聚集体的清除较为复杂一些。

对于部分抗体品种,聚集体比单体的吸附能力强,聚集体可以采取WPC方法去除,但对另外一些抗体品种,单体比聚集体与阴离子交换介质的吸附能力更强,这样品种就只能通过筛选阴离子交换介质或采用结合-洗脱阴离子交换方式去除聚集体。

在上一节介绍到,Arunakumari等在阳离子交换抗体捕获的基础上,采用一步阴离子交换精纯的两步抗体分离方法,可将宿主细胞蛋白和核酸降低到足够低的水平。

抗体纯化技术的另一个进展是膜层析技术日益广泛的应用,尤其是在阴离子膜层析方面。阴离子交换层析膜与填料层析介质使用的是同样的活性基团,但膜层析具有如下几个显著优势。

一是速度快,膜层析通过对流方式,使杂质能够直接接触到膜上所有的结合位点,开放式模孔结构利用分子扩散,可同时保证高流速和高载量。

二是载量高,膜层析动态载量可高达l-10kg/L膜体积是填料层析的10-100倍。三是体积小,缓冲液用量降低。膜层析回收率可达95%-100%,在宿主细胞蛋白去除、核酸去除及病毒去除能力方面也与填料层析类似,具备替代传统填料层析的优势。膜层析为一次性使用,在成本上比循环使用的填料高。

讲一讲:疏水层析

疏水层析和反相层析分离物质的依据是一致的,利用疏水介质的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。

该方法基于的是蛋白质的疏水差异,在高盐溶液中,蛋白质会与疏水配基相结合,而其他的杂蛋白则没有此种性质,利用此种性质,可以将蛋白质初步的分离,用于盐析之后的蛋白质进一步提纯。

蛋白质的疏水性强弱取决于其表面疏基团的分布,同时与样品缓冲液的离子强度,离子种类,pH,所处的温度都有一定的关系,在进行疏水层析时要保持恒定的温度,且要对样品缓冲液的离子种类及离子强度,pH进行筛选对比分析。

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