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盘点目的蛋白在大肠杆菌中的几大表达形式

发布时间:2021-06-30     浏览次数 :0

通过外源基因在蛋白表达系统的体外表达,并研究该基因的结构、功能,是分子生物学研究的一个重要组成部分。蛋白质的体外表达包含了在融合表达和非融合表达,还包括了在哺乳动物表达系统、酵母表达系统以及昆虫细胞表达系统中的表达。大肠杆菌具有遗传性状了解透彻、生长快、培养经济和表达水平高等特点,因此长期以来大肠杆菌表达一直是表达外源蛋白的首选表达系统。

大肠杆菌表达系统是蛋白表达的首选工程菌,也是目前最为广泛应用的经典原核表达系统。美迪西科研人员建立了成熟的大肠杆菌表达及纯化服务平台,提供包括各种重组蛋白以及其复合物在大肠杆菌中的表达与纯化服务。大肠杆菌被细胞外膜和内膜隔成了3个腔,大肠杆菌表达的目的蛋白液定位在胞内、胞外和周质这3个腔内。根据表达产物的定位,目的基因在大肠杆菌中的表达形式一般分为胞内表达和分泌表达。其中胞内表达是最主要的表达形式,其表达产物可以分为可溶性表达和不溶性的包涵体形式。而根据目的蛋白的本身的性质,目的蛋白在大肠杆菌表达形式又分为融合表达和非融合表达。

1、胞内表达

大肠杆菌表达的目的蛋白常定位于胞内,为避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长或者形成包涵体,可溶目的蛋白可借助本身的功能序列以及大肠杆菌蛋白质的加工、运输体系,最终穿越细胞膜,分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间或者细胞培养液中。

2、分泌表达

目的重组蛋白质跨过大肠杆菌内膜到达周质空间,或者穿过外膜达到胞外可称为分泌。已发现的大肠杆菌蛋白分泌到周质空间和胞外的跨膜转运相关的一系列Sec蛋白顺序结构有SecA、SecB、SecD、SecE、SecF、SecG和SecY[9,这7个。除了Sec蛋白,还有GroES/GroEL、DnaK/DnaJ和h/Ffs等分子伴侣也参与转运。

3、可溶性表达

目的基因在大肠杆菌的表达通常是能够获得具有生物活性的可溶性表达,然而外源蛋白往往在获得高水平表达的同时,容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵体。因此需要探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。提高重组蛋白的可溶性表达,首先需要选择合适的载体与宿主菌,其次还可以降低重组蛋白合成的速率。

蛋白质动力学模型研究表明,活性蛋白的产率取决于蛋白合成的速率、蛋白折叠的速率、蛋白聚集的速率。在高水平表达时,新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。因此,降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。常用的方法有降低培养温度、选择适当的启动子、使用较低浓度的诱导剂。

培养基的组成对提高大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达有显著影响。分子伴侣是一类能帮助多肽链形成正确三维结构的蛋白质,它主要通过阻止或校正出现不合理的疏水结合来帮助肽链的折叠。研究发现,与分子伴侣共表达可提高目的蛋白的可溶性,并且如将几种分子伴侣同时表达,有可能获得比单独使用更好的效果。值得一提的是,共表达分子伴侣的选择应根据重组蛋白自身的特点进行。蛋白质的一级结构即氨基酸序列,是影响包涵体形成的一个重要因素。将蛋白质中的某个或几个氨基酸进行替换,可抑制包涵体形成增加表达产物的可溶性。其可能的原因是突变后重组蛋白的疏水性发生变化或重组蛋白稳定性增加。

4、形成包涵体表达

但当目的蛋白大量表达时导致表达产物在大肠杆菌中积累,会形成无活性的固体颗粒,称为包涵体。包涵体目的蛋白具有正确的氨基酸序列,但由于没有经过正确折叠,空间构象错误,一般是没有生物活性的。与可溶目的蛋白产物相比,包涵体具有富集目的蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点。包涵体形成的主要原因是在重组目的蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子、或环境不适无法形成正确的次级键等。影响包涵体形成的因素主要有蛋白质本身的性质、培养条件、分子伴侣蛋白等。

5、融合蛋白表达

融合蛋白表达是将两个或多个基因的编码区首尾连接,然后由同一调控序列控制,从而目的蛋白融合表达的效率高、降解少、纯化简单方便。另外还可以利用构建于融合表达载体中的化学试剂断裂位点或蛋白酶切位点,在体外去除融合蛋白的原核肽段,从而得到天然蛋白产物。因为融合蛋白容易制备,有较高机率保持原有蛋白的活性及免疫原性,还可以进行商品化构建为后续裂解融合蛋白获取其内的真核蛋白提供可能。而且融合表达不仅可以提高蛋白表达量,还可以帮助目的蛋白正确折叠,从而获得可溶蛋白。

目前较为广泛使用的融合表达系统有PA系统、PG系统、His融合系统、GST系统、FLAG系统、MBP系统、TrxA融合系统等。原核表达的表达产物效率高、比较稳定,不易被宿主降解。

6、非融合蛋白表达

非融合表达不与宿主细胞的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白,是将目的基因插到表达载体的强启动子和SD序列的下游,以目的基因的起始密码子AUG为翻译起点。表达的目的蛋白肽链的N端不含有原核表达载体所表达的蛋白,其表达的目的蛋白在序列、结构、免疫原等与天然蛋白一致。非融合蛋白容易被宿主细胞内的蛋白酶降解或破坏而产生无活性的蛋白质,影响表达效率。

外源蛋白在大肠杆菌中表达具有表达水平高、易于操作和成本低廉等优点,常见的表达形式有胞内表达、分泌表达、可溶性表达、不溶性的包涵体形式,以及融合表达和非融合表达这几种形式。外源蛋白在大肠杆菌中的表达是一个系统的工程,因此在研究过程中应积累经验,找出提高重组蛋白表达效率的关键因此,使采用大肠杆菌表达系统大量表达外源活性蛋白成为可能。

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